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全光谱流式细胞术是近年来发展起来的一种新型流式检测技术，因其能够解析光谱特征高度相似的不同染料而备受瞩目。通过全波长光谱解析，可以大大扩展流式实验方案的分析维度，从而可以发现传统流式检测不出来的稀有细胞和自发荧光很强的细胞亚群。
通过以下实验我们详细阐述了利用Bigfoot全光谱流式分选仪检测不同组织样本中28色小鼠免疫分型的流式结果，以及用Attune NxT流式细胞仪评估六路分选后不同细胞亚群的分选效率、纯度和回收率。
28色小鼠免疫分型方案——高参数流式分析的重要性
免疫分型方案是利用流式细胞术鉴定、表征和区分样本中不同种类免疫细胞亚群的实验方法，主要是通过荧光标记的抗体来检测细胞表面或细胞内表达的抗原水平来实现。过去受传统流式细胞仪检测通道数量的限制，一次实验检测的抗原指标有限，不仅浪费试剂、样本和上机时间，而且还不能检测共表达的细胞亚群。例如，小鼠Ly6G是单核/巨噬细胞和粒细胞的常规检测指标，但某些T细胞也有表达，因此当淋巴细胞和髓系细胞分开检测时，通常不会研究表达Ly6G的CD4和CD8 T细胞，从而限制了对免疫功能评价的全面了解。然而利用Bigfoot全光谱流式细胞分选仪和经过优化的小鼠28色免疫分型方案可以全面、高效地分析和分选样本中的不同免疫细胞亚群。
材料和方法
01样本制备
分别取无特定病原体（SPF）的BALB/c小鼠的脾、淋巴结、股骨和胫骨组织，用完全培养基[含GlutaMAX™ 添加物 (货号: A41923-01)的Gibco™ BenchStable™ RPMI 1640培养基; 5% Gibco™ 热灭活的胎牛血清 (货号: A5209501); 50 单位/mL Gibco™青链霉素 (货号: 15070-063)]冲洗股骨和胫骨获取骨髓样本，并用70um细胞筛网进行过滤。脾和淋巴结经研磨后分别用上述完全培养基制备单细胞悬液，并用70um细胞筛网进行过滤待用。
脾细胞和骨髓样本用Invitrogen™ eBioscience™ 10X 红细胞裂解液 (货号: 00-4300-54)裂解红细胞，之后用含100 μg/mL DNase I (Millipore-Sigma, 货号: 11284932001)的完全培养基进行洗涤，用Invitrogen™ Countess™ 3 FL自动细胞计数仪 (货号: A49893)进行细胞计数，并调整细胞浓度为1 x 10⁷ 个/mL。
02样本染色
上述细胞先用Invitrogen™ eBioscience™ Staining Buffer (货号: 00-4222-26)和小鼠Fc Block™ (BD, 货号: 553142) 孵育5分钟后，用含5 μL/test的Invitrogen™ CellBlox™ Blocking Buffer (货号: B001T03F01) 和5 μL/test 的Invitrogen™ eBioscience™ Super Bright Complete Staining Buffer (货号: SB-4401-42)的流式抗体（表2）4°C避光孵育20分钟进行抗体染色；之后用Invitrogen™ LIVE/DEAD™ Fixable Olive Viability Kit (货号: L34978) 4°C避光孵育20分钟进行死活细胞染色；最后用2% 甲醛 (BioLegend, 货号: 420801) 室温避光固定30分钟。
设门策略
1.在SSC-A/SSC-H点图中圈出单个细胞群
2.在FSC-A/SSC-A点图中去除细胞碎片
3.利用LIVE/DEAD Fixable Olive死活染料去除死细胞
4.通过指标TER-119⁺去除红细胞，并圈出CD45⁺细胞进行进一步分析
5.中性粒细胞共表达Ly6G 和 Ly6C
6.进一步分析Ly6G⁻细胞中Siglec-H和Ly6C的表达情况
实验结果
图1. 利用28色免疫分型方案鉴定和分选小鼠脾细胞的设门策略。蓝色代表顺序逻辑设门关系；绿色代表分析出的各种细胞亚群；橙色代表分选出的各种细胞亚群。
图2. 脾细胞样本中各细胞亚群鉴定和分选的流式结果。
图3. 骨髓和脾细胞中各个B细胞亚群表达情况的比较。
分选后评估
01分选效率
分选效率是指分选仪报告的细胞数占样本中所有目的细胞的百分比。用分选的6种细胞亚群分别重复3次实验，每次分选的样本和细胞数不同，但样本中目的细胞亚群的阳性率是一致的 (MZB 细胞 = 1.5%, CD8+ naive T 细胞 = 2.5%, NK 细胞 = 2.7%, Treg 细胞 = 3.4%, T1B 细胞 = 1.9%, and DCs = 0.38%)。
图4. 分选效率评估结果。
02回收率
回收率是指分选出的目的细胞占分选前样本中所有目的细胞的百分比。
图5. 分选回收率评估结果。
03纯度
纯度是指分选样本中的目的细胞占所有细胞的百分比。
图6. 分选纯度评估结果。小鼠脾细胞中分选出的不同细胞亚群的纯度结果，分选前后的设门策略没有进行调整。
结论
Bigfoot全光谱流式细胞分选仪可以高维解析光谱特征相近的荧光染料，因此可以大大扩展流式多色方案，从而获得更多样本信息。通过以上28色小鼠免疫分型方案可以鉴定出20多种不同的细胞亚群，并且通过六路分选高效地分选出不同组织样本中的稀有细胞。
以下为不同小鼠细胞亚群的分型方案（上下滑动查看更多）：
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