磁微粒发光反应原理与方法详解！
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化学发光技术是近二、三十年来发展起来的一种测定方式。该技术的原理是利用化学反应释放的自由能激发中间体(常用碱性磷酸酶-金刚烷胺、辣根过氧化酶-鲁米诺衍生物、辣根过氧化酶-鲁米诺衍生物），使其从激发态回到基态。当中间体从激发态回到基态时会释放等能级的光子，对光子进行测定而进行定量分析（见图2）。化学发光具有荧光的特异性，同时不需要激发光，避免了荧光分析中激发光杂散光的影响从而提高了灵敏度，并且避免了放射分析造成的环境污染和健康危害，是一种非常优秀的定量分析方法。
化学发光免疫分析（CLIA）是一种高度敏感的微量测定技术，凡具有抗原性的物质（包括半抗原）都可以用CLIA测定。CLIA起步于80年代初，快速发展于90年代具备以下特点 ：
①高度敏感，极限达10-17－10-19mol/L，远高于放射性免疫（RIA）、酶联免疫（EIA）。与时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)相当，但比TRFIA便宜。
②特异性强，重复性好CV＜10％。
③测定范围宽，可达7个数量级。
④试剂稳定性好，无污染有效期12月。
⑤操作简单，易于自动化。
磁微粒化学发光免疫分析是将磁性分离技术、化学发光技术、免疫分析技术三者结合起来的一种新兴分析方法，其基本原理见图3 。该技术充分利用了磁性分离技术的快速易自动化性，化学发光技术的高灵敏度性，以及免疫分析的特异性，在生物分析领域展现了不可替代的作用。
图3. 磁微粒化学发光免疫检测（双抗夹心法）原理示意图
目前磁微粒化学分析免疫分析已经应用于管式化学发光免疫检测项目以及电化学发光免疫检测项目。
磁珠用于化学发光领域的方法
间接法
间接法就是包被抗原，然后用酶标记的抗抗体检测样本中抗体，基本原理见图4，适合于检测对象是自身抗体的情况。间接法的优点：相对较方便，只要变换包被抗原就可以检测不同的项目。间接法的缺点：标本中的特异性抗体会竞争性的结合抗原，使结果出现假阴性。
图4. 采用间接法进行化学发光检测基本原理
操作步骤：
a)磁性微球表面固定抗原。
b)加入样本（含目标抗体）孵育，清洗。
c)加入酶标抗抗体孵育，清洗。
d)加发光底物，检测信号。
捕获法
血清中针对某些抗原的特异性IgM常和特异性IgG同时存在，后者会干扰IgM抗体的测定，因此测定IgM抗体多用捕获法。基本原理如图5所示，先将所有血清IgM（包括异性IgM和非特异性IgM）固定在固相上，去除IgG后测定特异性IgM。
图5. 采用捕获法进行化学发光检测基本原理
操作步骤：
a)将抗人IgM抗体连接在固相载体上形成固相抗人IgM，洗涤。
b)加入稀释的血清标本中的IgM抗体被固相抗体捕获洗涤除去其他免疫球蛋白和血清中的杂质成分。
c)加入特异性抗原试剂：它只与固相上的特异性IgM结合洗涤。
d)加入针对特异性的酶标抗体：使之与结合在固相上的抗原反应结合洗涤。
e)加底物显色，检测信号。
固相抗原竞争法
竞争法，是指受检抗体和酶标抗体竞争性的与磁珠表面抗原结合。固相抗原竞争法基本原理如图6所示。结合于固相载体的酶标抗体与受检抗体的量呈反比。若受检样本中无抗体，酶标抗体能够顺利与抗原结合，出现强信号。若受检样本中有抗体，则竞争性的占去了酶标抗体与抗原的结合，酶标抗体的结合力减弱，信号强度减弱。
图6. 采用固相抗原竞争法进行化学发光检测基本原理
操作步骤：
a)磁珠表面固定特异性抗原。
b)加受检标本和酶标抗原的混合液孵育。
c)加发光底物，检测信号。
双抗夹心（两步法）
双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，基本原理如图7所示。
图7. 采用双抗夹心法（两步法）进行化学发光检测基本原理
操作步骤：
a)将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂。
b)加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时问，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。
c)加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量成正相关。
d)加发光底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。
双抗夹心法（一步法）
在一步法测定中，应注意钩状效应（hook effect），类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象。当标本中待测抗原浓度相当高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成夹心复合物，所得结果将低于实际含量。钩状效应严重时甚至可出现假阴性结果（如图8， 双抗夹心法及双位点一步法。缺点：假阴性）
图8. 采用双抗夹心法（一步法）进行化学发光检测基本原理
图9. 采用双抗夹心法（一步法）进行化学发光检测，当样本中抗原量较多是，容易出现假阴性。
操作步骤：
a)磁珠表面固定一抗。
b)加样本和酶标二抗孵育，清洗。
c)加发光底物，检测信号。
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