细胞培养相关知识小结 （详细版）
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一、操作前准备工作： 1.75％酒精擦拭生物安全柜台面，摆好废液缸。取出所需的培养基，PBS，胰酶 等提前预热； 2.开紫外灯照射超净工作台15-30min； 3.关闭紫外灯后开鼓风机吹5分钟； 4.戴手套，75％酒精擦拭，同时将提前预热好的培养基、PBS、胰酶等用75％酒 精擦拭后，放置于生物安全柜工作台上。 二、细胞复苏（原则缓冻速溶）： 1.提前打开37℃水浴锅，保证开始复苏细胞时水浴锅温度能达到37℃； 2.从液氮中取出细胞； 3.迅速置37℃水浴，1min内融化，将冻存管用75％酒精擦拭后，置于生物安全柜 工作台上； 4.打开培养基瓶盖（开盖前酒精棉擦拭盖口边缘），培养基瓶放在瓶架上，瓶盖 放在“非工作区”，以免工作时污染； 5.用一次性巴氏吸管或移液枪取5mL新鲜的完全培养液于新的15mL离心管中，再 用移液枪吸出冻存管里的细胞悬液，滴加到离心管内，1500rpm离心3min； 6.弃上清，根据冻存时候的细胞数量，选择合适的培养皿，用适当体积的新鲜的 完全培养液重悬细胞沉淀，并将细胞沉淀转移至干净的培养皿中，混匀，显微 镜下观察细胞状态； 7.放入37℃，5%CO2培养箱中培养，第二天观察细胞成活情况及状态，并换液（有 些比较特殊的细胞贴壁较慢，换液时间要视情况而定）； 8.收培养基等，75%酒精擦拭操作台面，关闭生物安全柜； 9.冲洗废液缸。 三、贴壁细胞的传代培养： 1.打开培养皿（瓶）盖（盖放在“非工作区”，盖、培养皿口不能接触任何物品）， 倾斜吸出所有的培养基； 2.加入适当PBS润洗（以覆盖皿（瓶）底为宜），倾斜吸出PBS； 3.加入0.5ml-1ml胰酶溶液，混匀，均匀覆盖细胞，放入37℃细胞培养箱中消化 1-2min（有些细胞比较难消化，要适当增加消化时间）； 4.显微镜下观察细胞，细胞胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明消化适度； 5.立刻加入新鲜的完全培养液终止消化，小心吹打混匀成细胞悬液，用移液枪或 巴氏吸管吸至新的15mL离心管中； 6.1500rpm离心3min，弃上清，加入适当体积的新鲜的完全培养液，用吸管轻轻吹 打成细胞悬液，按比例进行传代，将细胞悬液分配至新的培养瓶（皿）中，补 足完全培养液； 7.混匀，放入37℃，5%CO2培养箱中培养； 8.收培养基、胰酶等，75%酒精擦拭操作台面，关闭生物安全柜； 9.冲洗废液缸。 四、悬浮细胞的传代培养： 1.直接传代法： 1)打开培养皿（瓶）盖（盖放在“非工作区”，盖、培养皿口不能接触任何物品）； 2)按照传代比例加入适当体积的新鲜的完全培养基，小心吹打成细胞悬液，再按 照传代比例，等分装入新的培养皿（瓶）中； 3)盖好盖子，混匀，放入37℃，5%CO2培养箱中培养。 2.离心传代法： 1)打开培养皿（瓶）盖（盖放在“非工作区”，盖、培养皿口不能接触任何物品）； 2)将细胞悬液用移液枪或巴氏吸管吸至新的15mL离心管中； 3)1500rpm离心3min，弃上清，加入适当体积的新鲜的完全培养液，用吸管轻轻吹 打成细胞悬液，按比例进行传代，将细胞悬液分配至新的培养瓶（皿）中，补 足完全培养液； 4)盖上盖子，混匀，放入37℃，5%CO2培养箱中培养； 3.收培养基、胰酶等，75%酒精擦拭操作台面，关闭生物安全柜； 4.冲洗废液缸。 五、半贴壁细胞的传代培养： 1.打开培养皿（瓶）盖（盖放在“非工作区”，盖、培养皿口不能接触任何物品）； 2.用移液枪或巴氏吸管充分吹打培养皿（瓶）壁，使半贴壁细胞脱落下来（如果 细胞贴壁比较牢，可参照贴壁细胞的消化方式进行消化）； 3.将细胞悬液用移液枪或巴氏吸管吸至新的15mL离心管中； 4.1500rpm离心3min，弃上清，加入适当体积的新鲜的完全培养液，用吸管轻轻吹 打成细胞悬液，按比例进行传代，将细胞悬液分配至新的培养瓶（皿）中，补 足完全培养液； 5.盖上盖子，混匀，放入37℃，5%CO2培养箱中培养； 6.收培养基、胰酶等，75%酒精擦拭操作台面，关闭生物安全柜； 7.冲洗废液缸。 六、冻存： 1.接贴壁细胞的传代培养中第4步（避免消化时间过长，否则会影响冻存质量）； 2.立即加入新鲜的完全培养液终止消化，小心吹打混匀成细胞悬液，用移液枪或 巴氏吸管吸至新的15mL离心管中； 3.1500rpm离心3min，弃上清，加入事先配好的冻存液，调整细胞密度（每个冻存 管冻1mL细胞悬液，每管细胞数在5×106个左右），冻存管上标记清楚细胞名称、 代数、冻存时间以及冻存人员的名字缩写； 4.将冻存管放置于程序降温盒中，并转移至-80℃冰箱过夜，然后将冻存细胞转移 至液氮，长期保存； 注： 完全培养液：90%基础培养基＋10%FBS＋1%双抗溶液（有些培养基还需加入谷氨 酰胺、丙酮酸钠、非必需氨基酸等，具体培养液的配置参照中科院的配方） 冻存液：90％胎牛血清＋10％DMSO 注： 无菌操作的关键是有可能接触细胞的任何物品不能接触到未灭菌的物品。
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