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IVD研发必备：抗原抗体检测特性、原理、影响因素

2024-2-21 17:01:35

一，抗原或抗体检测的原理

其本质就是借助抗原和抗体在体外特异结合后出现的各种现象，对样品中的抗原或抗体进行定性、定量、定位的检测。

1．下聊一下抗原与抗体的亲和力(affinity)

抗原抗体的结合就像酶与底物的结合，激素与其受体的结合一样不是化学的反应，而是非共价键的可逆的结合。抗原决定簇和抗体分子可变区互补构型，造成两分子间有较强的亲和力。空间构型互补程度不同，抗原和抗体分子之间结合力强弱也不同。互补程度高，则亲和力强。此外，反应温度、酸碱度和离子浓度对抗原和抗体分子上各基因的解离性和电荷特性也有重要的影响，抗体与抗原决定簇之间的结合力大小可用亲合力来表示。高亲合力的抗体与抗原的结合力强，即使抗原浓度很低时也有较多的抗体结合抗原形成免疫复合物。

2．接着在看一下抗原或抗体外检测原理

根据抗原抗体结合形成免疫复合物的性状与活性特点，对标本中的抗原或抗体进行定性、定位或定量的检测。定性和定位检测比较简单，即用已知的抗体和待检样品混合，经过一段时间，若有免疫复合物形成的现象发生，就说明待检样品中有相应的抗原存在。若无预期的现象发生，则说明样品中无相应的抗原存在。同理也可用已知的抗原检测样品中是否有相应抗体。

对抗原或抗体进行定量检测时，以反应中加入抗原和抗体的浓度与形成免疫复物的浓度呈函数关系。

（1）根据免疫复合物产生的多少来推算样品中抗原（或抗体）的含量：

在一定的反应条件下，加入的已知抗体（或抗原）的浓度一定，反应产生的免疫复合物多少与待检样品中含有相应抗原（或抗体）量成正比。也就是抗体浓度一定时，免疫复合物越多则样品中的抗原量也越多。可用实验性标准曲线推算出样品中抗原（或抗体）的含量。如免疫单向扩散试验、免疫比浊试验和酶联免疫检测等都属于这类方法。

（2）抗原或抗体效价滴定的原理：

当抗原抗体复合物形成多少不能反应抗原抗体反应强弱时，就不能以检测反应强度来对抗原或抗体进行定量。在实际工作中，把浓度低的反应成分（抗原或抗体）的浓度固定，把浓度高的另一种反应成分作一系列稀释。例如用人血清作抗原免疫3只家兔，比较3只家兔产生抗体的多少，即滴定3只兔血清抗体效价，可用双向琼脂扩散法来滴定，例如将抗体浓度固定，将抗原作不同的稀释度，分别将抗原或抗体滴入琼脂的相应小孔中，观察免疫兔血清与不同稀释度的抗原出现明显沉淀浅的抗原稀释度（如甲兔的抗体效价为1/2000，而丙免的是1/8000则可比较出后者比前者产生抗体的效价要高）。也就是表示效价的稀释度越高，样品中所含待检成分越多。因人血清（抗原）和抗体（免疫兔血清）相比，浓度高，故应稀释抗原。

二，抗原抗体检测的影响因素

1，抗原的检测

检测抗原的免疫分析常用于感染性疾病的检测。病原体感染的快速检测可以防止疾病的扩散和增加对疾病流行病学的理解。对于一些感染原，免疫分析只能给出经验性的诊断。对其它的一些病原，在较短时间内就可以给出特异性的诊断。

不同抗原表位和相关抗体出现的检测，有助于感染期的判断，如，梅毒和腺病毒感染。在一些情况下，特定表位的研究也可以用于确定病原体新菌株的出现。

病原或病原抗原的免疫分析应该考虑几个潜在的问题：

1.1 表位

分析使用的抗体应该检测一直出现的表位，并且还要有病原体特异性。缺乏对此类表位的了解是阻碍可靠免疫分析研发的一个主要因素。

1.2 抗原浓度

不同病人和相同病人不同样本的抗原浓度有很大不同，有时相差几个数量级。抗原浓度过低，如果低于分析的检出限，则会产生假阴性结果；倘若浓度过高又会产生后带现象，从而低估抗原的含量。

1.3 基质效应

病人的样本有多种来源（如，血、尿、脑脊液和脓），并且不同病原提供的样本也不同。基质的不同对分析的性能影响较大。

1.4 样本的处理

许多病原体和抗原是易变的，即，对PH、温度、大气压以及白细胞或细菌性污染物的存在非常敏感。相同分析的不同样本和不同分析的相同样本的处理方法可能不同，应该详细说明处理的要求并要严格遵守。

2 ，抗体的检测

在临床检验中抗体的免疫分析也很重要：

1）确定病人是否已经接触了病原体和已经对其产生了抗体；

2）评价一个人对感染和免疫接种的免疫反应状态；

3）确定疾病是否被控制了；

4）研究疾病在人群中的蔓延和流行。

在许多方面，抗体的分析比抗原的分析存在的问题少。首先，样本一般只用血清、血浆或脑脊液，所以基质的问题可能不会存在。其次，浓度通常变化不大，所以分析很少出现抗原或抗体过量。

抗体分析存在的问题，包括：

2.1 IgG抗体

免疫球蛋白G（IgG）的出现说明机体的感染不是当前的、活动期的感染而是先前的感染。所以，IgM抗体的检测或几个星期后IgG水平（效价或其它检测）的检测对疾病的诊断是有用的（后者是回顾性的）。由于两次检测分析的反应性不同，配对样本应该在同一时间检测；如果需要在开始就检测样本，可以分装冻存一定量的未处理样本然后与后来得到的样本一起检测。

2.2 IgM抗体

许多检测IgM抗体的分析是不可靠的，这些分析只检测IgM或与IgG一起检测。尤其是后者，在分析临床样本之前，厂商和实验室应该利用只包含IgM抗体的样本充分证明分析的性能。

2.3 抗体水平

严重感染和免疫抑制药物的治疗，可以导致抗体水平低于分析检出限以下。从而导致感染了病原的病人出现假阴性。另外，抗体的水平可能不与感染的严重性、免疫程度或病人免疫系统产生免疫反应的能力有相关性。

2.4 溶菌抗原

在检测抗体的分析中，如果用病原体的原始溶菌产物做抗原的话，会产生非特异性的干扰。纯化抗原或使用重组抗原，可以在不影响敏感性的情况下提高分析的特异性

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