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致敬DNA双螺旋结构发现70周年——PrimeFlow 流式RNA分析

2023-4-13 18:19:51

1953年，英国《Nature》杂志刊登了DNA双螺旋结构模型，从此开启了分子生物学的大门。这已经过去了70年，赛默飞为科学家提供完整的流程解决方案，更加高效地解决实验问题。在日新月异的当下，科学技术飞速发展，在此为您推荐——Invitrogen™ PrimeFlow™ RNA流式检测方法。

首先，一起看看赛沃娃娃的故事

在赛默飞，Invitrogen™ PrimeFlow™ RNA流式检测允许同时检测数百万个单细胞内的RNA和蛋白表达水平。其技术原理是将荧光原位杂交技术（FISH）和分支链DNA（bDNA）信号放大专利技术相结合，分别用Alexa Fluor™ 488、Alexa Fluor™ 568、Alexa Fluor™ 647和Alexa Fluor™ 750进行标记，同时检测单个细胞中多达4种RNA转录本。同时再结合细胞表面和细胞内抗原染色，更加深入地揭示生物学现象。

为什么选择PrimeFlow流式RNA实验？

超高特异性 | 超强灵敏度 |

同时检测RNA和蛋白 | 流式实验独特优势

PrimeFlow RNA分析实验流程

PrimeFlow RNA流式检测实验流程的主要步骤有：抗体染色；固定和破膜，如需可加细胞内染色；然后是与含有20-40个寡核苷酸对的靶点特异性探针进行杂交。

应用一：

同一细胞中的RNA和蛋白表达水平研究
。在刺激细胞后，不同程度的RNA转录使蛋白表达水平也各不相同。而且，在某个固定时间点，研究基因的RNA水平和蛋白表达可能有所差异。目前现有的方法如qPCR或芯片技术还不能同时检测RNA和蛋白，科学家必须在两者中选择其一。PrimeFlow可以揭示不同细胞亚群中mRNA和蛋白动力学变化，并鉴别出在刺激作用下其表达差异随时间的变化。

IFNγ和TNFα转录和翻译之间的相关性和动力学

目标：

流式细胞内染色和分析常用于评估淋巴细胞等异质性样本中单细胞水平的细胞因子生成。本文采用PrimeFlow RNA分析结合细胞内抗体染色，研究淋巴细胞亚群中IFNγ 和TNFα转录和翻译的动力学。

结果：

刺激后1小时内，CD8⁺和CD8⁻淋巴细胞中的IFNγ mRNA表达上调，而直至刺激后2小时，才检测出蛋白质水平变化。在随后的3–4小时，IFNγ mRNA和蛋白质水平保持不变(图1A和1C)。相比之下，在CD8⁺细胞中，刺激后1小时TNFα mRNA和蛋白质表达均上调，然后保持不变，而CD8⁻细胞中的表达水平在1–2小时到达顶峰，并在随后的4小时内有所下降，mRNA的下降先于蛋白质(图1B和1D)。

图1. 利用PrimeFlow RNA分析检测IFNγ和TNFα转录和翻译动力学。使用Invitrogen™ eBioscience™细胞刺激混合物(含蛋白转运抑制剂) (货号: 00-4975) 刺激正常人外周血单核细胞0–5小时。使用PrimeFlow RNA分析，固定并破膜处理细胞，然后进行CD8、IFNγ和TNFα抗体的细胞内染色。随后，细胞经过一系列的杂交步骤，标记IFNγ和TNFα mRNA。淋巴细胞设门内的活的CD8⁺和CD8⁻细胞用于分析。A和C显示了IFNγ的动力学，B和D显示了TNFα的动力学。

结论：

利用PrimeFlow RNA分析，我们发现IFNγ和TNFα mRNA及蛋白质的诱导具有独特的动力学特点，TNFα蛋白质和mRNA在CD8⁺和CD8⁻淋巴细胞中呈差异性调控。利用该分析可以对异质性样本进行单细胞水平的基因表达研究，无需分选细胞亚群，且能够直接同时对比mRNA和蛋白质诱导的动力学。

应用二：感染细胞中的病毒RNA水平研究

同时感染多种病毒颗粒会导致病理学和发病率增加，例如AIDS患者同时感染人免疫缺陷病毒(HIV)和丙肝 (HCV)，或乙肝和丙肝超感染。逐一排除各个病毒在单细胞里的干扰，有助于未来的疫苗设计和生产。迄今为止，还没有追踪和研究单个共同感染细胞的可靠方法。PrimeFlow RNA分析可用于通过流式细胞术直接检测单细胞中的多种病毒转录本，开启共同感染的细胞群体的详细研究。

共同感染的人肝细胞中丙肝病毒RNA的检测

方法：

肝细胞同时感染两种HCV菌株-JFH1野生型(WT)和JFH1密码子异常型(CA)。设计特异性探针，以区分两种HCV菌株，研究共同感染的细胞中的支配关系。然后使用PrimeFlow™ RNA分析和ViewRNA™两个技术验证探针特异性。

结果：

PrimeFlow RNA分析明确区分了JFH1-WT单阳性、JFH1-CA单阳性和双阳性细胞群体(图2)。利用正交ViewRNA分析确认探针设计对标示的HCV菌株具有高度特异性(图3)。

图2. 单细胞共感染病毒RNA原理验证。* 肝细胞感染JFH1-WT菌株 (左上) 或 JFH1-CA (右上)。感染后，将分别感染上述两种病毒的单感染肝细胞混合(左下)，或者肝细胞同时感染JFH1-WT和JFH1-CA (右下)。使用Invitrogen™ QuantiGene™ FlowRNA分析，对肝细胞中的菌株特异性病毒RNA进行分析。

图3. 特异性显示。* 使用ViewRNA原位杂交技术以及PrimeFlow RNA分析中使用的相同的探针组对感染JFH1-WT (上排)或JFH1-CA (下排)的肝细胞进行分析。

选择PrimeFlow 探针的好帮手

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本文章来自赛默飞生命科学

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