注意好2点，你的荧光WB能拍到更多条带
|
化学发光Western PK 荧光Western 由于化学WB一次只能显现一种蛋白的条带，科学工作者一直在寻找在一张膜上同时显现更多条带的方法，方便同时获取更多平行数据，提高数据的收集效率，让实验更准确和更高产，比如可以同时观察到目标蛋白和上样内参蛋白，区分具有相似分子量的蛋白质（磷酸化和去磷酸化蛋白），并评价复杂的生物学通路（多个蛋白同时成像）。 技术总是在不断进步，荧光染料的不断迭代更新，成像设备的出现替代暗室，让多个条带同时成像变得触手可及。
进行荧光WB的关键点
图1. 荧光蛋白质免疫印迹适用传统800 近红外二抗（下图）与 Alexa Fluor Plus 800 二抗（上图，羊抗兔 IgG 二抗，货号 A32735）检测热休克蛋白 90（Hsp90）和组蛋白脱乙酰酶1（HDAC1）的表达。
图2. 明显光谱重叠的示例。上图为在线荧光光谱查看器生成的图像，该示例中，Alexa Fluor Plus 647和Alexa Fluor 680荧光基团的部分激发和发射光谱都在激发和发射滤光片的范围内，因此会同时激发两种荧光基团，此时，它们发射的荧光都会到达摄像头的探测器，导致难以区分检测到的荧光的来源。
图3. 具有不同激发光谱的荧光基团进行多重检测实验的示例。上图为荧光光谱查看器生成的图像，该示例中，Alexa Fluor Plus 488和Alexa Fluor 546荧光基团的激发光谱（虚线）在激发滤光片的范围内具有最小重叠。尽管两种荧光基团的部分发射光谱（实线）都在发射滤光片的范围内，但AlexaFluor 546不会被用于Alexa Fluor Plus 488的激发滤光片所激发，因此来自Alexa Fluor 546的荧光不会通过发射滤光片。
图4. 具有不同发射光谱的荧光基团进行多重检测实验的示例。上图为荧光光谱查看器生成的图像，该示例中，Alexa Fluor Plus 680和Alexa Fluor790的发射光谱（实线）在两种发射滤光片的范围内无重叠。尽管两种荧光团在激发滤光片1的范围内具有部分激发光谱（虚线）重叠，但在该激发范围内产生的任何Alexa Fluor 790荧光的波长都不能通过发射滤光片1，因此来自Alexa Fluor 790的荧光将无法到达该通道中的摄像头探测器。 本文来自赛默飞生命科学，如有侵权请联系！ |
小贴士：提示：使用iBright FL1500成像系统成像时， 对于低丰度靶标蛋白，使用较亮的低波长荧光染料（例如，Invitrogen™ Alexa Fluor™ 546和Alexa Fluor Plus 647），相反，对于高丰度靶标蛋白，使用较高波长荧光染料（例如，Alexa Fluor Plus 680和Alexa Fluor Plus 800探针）。
微信公众号下单更便捷
