总RNA质量到底如何检测？这些分析你需要知道
|
提取总RNA后，需要对RNA的纯度和浓度进行检测，方知我们提取的总RNA到底合不合格，而且后续的逆转录PCR体系配置过程，也需要用到总RNA的浓度值。 检测RNA的方法主要有两种，即光密度法和电泳法。 （PS：有的教程还整出测RNA酶的方法，即“保温试验”，这种方法不推荐而且也不可靠。因为就算证明有RNA酶存在又怎样？不代表RNA就被降解了。科学的思维是，要直接证明才能说明问题。好比：喝了毒药一定中毒吗？不一定，还得看毒药的浓度，还有个体的反应。更何况，这种方法还无法鉴别是不是由于做这个试验过程才污染的RNA酶呢？） 一、光密度法 光密度法是利用分光光度计测定RNA的紫外吸收值，即OD230，OD260和OD280。 （1）对于纯度高的RNA样品，OD260和OD280的比值应介于1.8～2.0之间： ①如果260/280＜1.8，表明RNA样品中可能存在蛋白质和苯酚的污染； ②如果260/280＞2.0，表明可能存在RNA降解。 （有的文章是说比值在1.8~2.2之间，但本文1.8~2.0的数据来源于易继财教授2020年主编的《基因工程原理与实验》，许多出版的教材都是这个范围。） （2）OD260与OD230的比值应大于2.0，否则表明RNA可能存在异硫氰酸胍的污染。 依据OD260值大小可以计算出RNA的浓度，一般来说，1 OD260相当于RNA浓度40μg/mL。 二、电泳法 对于RNA的完整性，可以通过电泳检测。RNA分子在凝胶中的迁移速度与其长度有关，一般情况下，长片段RNA比短片段移动慢，但是单链的RNA分子极易通过分子内碱基配对形成广泛的二级结构，从而影响其在凝胶中的迁移率。 在大多数情况下，应在变性条件下进行RNA电泳，使RNA的二级结构不能形成，这样才能保证RNA的迁移率与分子量大小呈正相关性。 真核生物的总RNA中富含28S和18S两种核糖体RNA（rRNA），二者在变性电泳中的迁移率分别相当于5.1kb和2.0kb的片段。在紫外透射仪上观察，一般28SrRNA条带的亮度是18SrRNA的两倍，表明RNA完整，且未发生降解，否则表明28S rRNA可能部分降解为18 SrRNA大小的片段，即RNA的完整性受到破坏。即：28s：18s=2：1是判断RNA是否降解的标准。 因为降解，总是从大片段开始降解，从28s降解到18s，最后降解到5s。这样降解过程中，28s减少，18s增多，28s：18s比例就会下降。如果最容易降解的28s都没有降解，那么，就推理出：mRNA是完好的了。 有的教程会纠结5S条带出不出现的问题，认为用trizol沉淀法提取的可以出现，而RNA吸附柱法提取的不应该出现，理由如下： 总RNA=mRNA+tRNA+rRNA，即：总RNA就是指mRNA、tRNA、rRNA的总和。这个概念是在还没有发现microRNA的时候的产生的，却被各大RNA提取试剂盒生产公司所默认，一直延续至今。也就是说在市场上你看到的“总RNA提取试剂盒”，只对mRNA、tRNA、rRNA负责，提出来的是这三种RNA的混合物，重点是对mRNA负责。所以各位可以去各大公司的网站，看一看总RNA提取试剂盒案例所配的RNA电泳图，只有代表“总RNA”的2条带——28s和18s；代表microRNA的5s带，要不没有，要不很弱。这就是目前各个公司总RNA提取试剂盒中“总RNA”的概念。 以上可知，RNA吸附柱法提取的5S条带应该“要不没有，要不很弱”，言外之意还是可以有，而且现在也有提microRNA的吸附柱试剂盒出现了，这种情况下试剂盒提取的也会有5S条带。要我说，就不用过于关注5S条带的问题，按教科书标准，只需要关注28s：18s是不是接近2：1。 如果只需要对RNA的完整性进行快速鉴定，有时可以利用1.5%～2%普通琼脂糖凝胶进行常规电泳检测。 如果还要测定RNA的分子量，则必须使用变性凝胶电泳，利用合适的RNA分子量标准来预测样品RNA的分子量大小。由于Northern杂交分析通常是根据RNA的分子量大小来进行RNA分子表征，因此在RNA电泳时必须使用变性凝胶电泳。常用的RNA变性剂一般有甲酰胺和甲醛等，这些试剂都具有毒性，操作时需小心谨慎。 下面，附一张电泳图（取自网络）：
1.生化与分子生物学实验技术 2.分子克隆 3.基因工程原理与实验 本文来自：生命科学宝公众号，如有侵权请联系删除！ |
微信公众号下单更便捷
